고등학교 생명과학실험 ⑨ - 플라스미드 DNA 제한효소처리 실험

1. 실험원리<제한효소>제한효소는 외부에서 들어온 DNA의 특정 염기서열을 인지하여 DNA를 내부에서 절단하는 핵산스토리 단가분해효소(endonuclease)로 DNA를 같은 장소에서 정확하게 자를 수 있으며, 재조합 DNA를 만들 때 사용되는 효소이다. 많은 효소는 DNA 이중나선을 교대로 잘라 점척성 스트리던을 만드는데 이들은 일시적으로 수소결합을 해서 DNA연결효소(ligase)가 쉽게 DNA를 연결해 변형 DNA를 만들 수 있게 할 것이다. 세균은 외부의 DNA가 침입했을 때 이를 분해하기 위해 제한효소를 사용하는데, 나의 DNA 제한효소자리에 메틸기를 처음 넣어 제한효소가 자신의 유전자를 분해하는 것을 막는다. 제한효소는 특성에 따라 I, II, III형으로 구분되는데 세 가지 제한효소는 전체 마그네슘 이온을 보조 인제로 사용하며 각각 인식서열에서 DNA를 자르는 위치와 정밀도가 차이가 있다.

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<플라스미드 벡터> 플러스미드 벡터는 복제 원점, 프로모터, 항생제 저항성 유전자, 제한 효소 절편좌 등이 삽입된 플라스미드이다. 박테리아 염색체와 독립적으로 복제할 수 있는 원점을 가지고 있어야 합니다. 진핵세포의 유전자를 세균에 발현시킬 때 진핵세포와 원핵세포의 구조 차이와 유전자 발현 단계의 차이 때문에 복제와 전사를 할 수 없다. 진핵세포의 유전자가 삽입되는 제한효소 부위의 앞부분에 원핵세포의 프로모터를 삽입하면 세균은 원핵세포의 프로모터를 인식해 프로모터와 연결된 외부 유전자를 발현시킨다. 역시 제한효소의 절단점도 갖고 있어 플라스미드를 잘라 외부 DNA 조각을 쉽게 삽입할 수 있다. MCS(multiple cloning site)는 복제에 필요한 제한 효소 부위를 한곳에 모은 부위로 각각의 DNA 부위는 각기 다른 제한 효소가 인식하여 절단할 수 있다. 항생제의 내성 같은 보고 유전자를 가지고 있어 이 변형 플라스미드를 수용한 박테리아를 쉽게 선별할 수 있다.

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<실험에 사용한 제한효소> 이번 실험에서는 HinDIII와 BamHI라는 매우 많이 유명한 제한효소를 사용했다.HinD III제한 효소는 Haemophilus influenzae에서 추출한 제한 효소로 마그네슘 이온이 존재할 경우 5'-AAGCTT-3'을 인식하고 A와 A사이를 자르다. 보조 인자의 마그네슘 이온은 물과 결합해 효소의 활성 부위로 운반하는 역할을 한다. BamH I제한 효소는 Bacillus amyloliquefaciens에서 추출한 제한 효소로 5'-GGATCC-3'을 인식하고 G와 G사이를 자르다. 제한효소처리실험을 할 때 HinDII와 BamHI는 서로 방해할 수 있는 효소이므로 따로 처리해야 한다. HinD III는 80도로 불활성화되고, BamH I는 온도 변화에 불활성화되지 않아 본 실험에서는 HinD III제한 효소를 가장 먼저 처리하는 것입니다.​<실험에 사용한 플라스미드 벡터>실험에 사용하는 플라스미드 벡터는 pFLAG-CMV-2의 복제의 원점과 프로모터를 갖고 있지만 대장 균에서 DNA복제가 가능하도록 SV40 ori를 삽입하고, RNA중합 효소와 친화도를 높이고 인위적인 발현을 높이기 때문에 CMV promoter를 삽입한 플라스미드입니다. AmpR(ampicill in resistance gene)은 항생제 저항 유전자로 screening을 통해 형질전환이 제대로 된 대장균을 걸러낼 때 사용된다. FLAG-tag는 폴리펩타이드 서열로 아스파르트산, 티로신, 리신으로 구성된 DYKDDDK 서열을 의미한다. 이 서열이 발현한 플라스미드를 pFLAG라고 부르며 항체 형성에 관여하여 외부항원을 인식할 수 있다. 항체와 친화도를 높이다. CMV promoter는 CMV (cytomegalovirus) 의 프로모터에서 플라스미드 벡터로 목적한 유전자를 발현시킬 수 있다. ​ HinD III와 BamH I인식 자리에 치환 DNA기술로 SHP2유전자를 넣어 CMV2– Flag-SHP2-WT-MYC플라스미드를 만들었다. 플라스미드에 목표 유전자를 넣으면 플라스미드를 벡터로 이용해 대장균을 형질 전환시킬 수 있다."​ CMV2– Flag-SHP2-WT-MYCCMV2의 벡터-Flag tag단백질의 표시가 있다-SHP2단백질을 만들려고 유전자를 처음으로 가한-WT야생형-MYC제한 효소 단편의 자리. ​ Ezbuffer II는 HinD III와 BamH I효소가 동시에 100Percent로 작용할 완충제입니다. 이이에키 물에는 pH를 약한 염기로 만들어 주는 Tris-HCl과 NaCl이 있고 MgCl2는 보조 인자로 사용되고, BSA는 반응의 속도와 용액의 휘발성을 높이고 있다. ​ 2. 실험 재료

​ 3. 실험 과정 ​ 처음이다. 실험 전에 테이블을 에탄올로 닦고, 항온 수조의 온도를 37도로 맞춘다.

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2.PCR반응으로 틀에 사용한 DNA(한 00ng/㎕)을 준비하고 일.5mL E-튜브에 챠후그와 같은 조성에 용액을 만든다.

DW 12㎕을 가장 먼저 넣고, 플라스미드 DNA(100ng/㎕)5㎕, 10x Ezbuffer2 2㎕을 차례로 넣은 후, HinD III효소 1㎕을 마지막에 넣어 총 20㎕ 용액을 만든다.

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3.PCR연구과 같은 비법으로 10㎕ 피펫으로 스토리물을 섞어 준다. 용액을 만드는 과정에서 벽면에 붙어 있는 용액은 미니 원심분리기에 넣어 튜브 밑에 모은다.

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4.'동동이 '에 튜브를 넣어 37C에서 제한 효소를 잠시 동안, 반응시킨다. 본 실험에서는 시간 관계상 약 50분 반응시켰다.

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5.Heat Block으로 80도에서 20분 동안 HinD III을 불활성화시킨다. 이때 Heat Block구멍 속에 물을 넣어 튜브 속의 용액에 온도의 전달이 좋은 1어 나쁘지 않아도 록한다.

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6. 반응물 중 5㎕을 새로 E-튜브를 완화하고 single cut으로 표시하고 HinD III을 반응한 원래 튜브에 BamH I첫 ㎕을 첨가한다. ​ 7. 새로 튜브는 double cut으로 표시하고 37C에서 첫 시간 반응시킨다. ​ 8. 반응이 끝난 튜브는 겔 전기 영동을 돌리고 4도에서 보관한다.이후 과정은 전기영동인데 이 글을 확인하면 된다.https://m.blog.naver.com/sejinpark0첫/22첫 5첫 2첫 77202

​ 4. 실험 결과 ​

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​ 5. 토의 토의 스토리도 지난 글과 연결된 요약본만 간략히 적어 보려고 합니다.전기영동 결과 우리조는 아쉽게도 결과가 나오지 않았다. 예상 결과로는 제한 효소를 한 번 자른 플라스미드는 원형 플라스미드보다 저항을 더 많이 받아 천천히 이동한 것입니다. 이렇게 2번 찍은 플라스미드는 다른 길이의 2개가 나타난 것으로 예상된다.대장 균의 복제, 플라스미드의 증폭, 제한 효소 처리, 전기 영동 점검까지 1세트가 된 생명 공학 기술을 이용한 점검을 마쳤다. 교과서적으로 배우는 것보다 정확하게 실제 점검을 통해 얻는 것이 더 많았다. 이번 점검이 고교 생명과학 점검의 마지막이라 조금 아쉽기도 하지만 최근까지 배워온 스토리를 나중에 하나하나 돌이켜보면 당시의 즐거운 추억이 될 것 같다. 최근까지의 점검 보고서나 블로그 정리에 투자한 시간은 굉장히 많았지만, 의미 있는 시간이라고 소견합니다. 한번씩 정리하면서 내 지식으로 소화되는 상념으로 정리된 글은 언제봐도 재미있다. 어른이 되어 넓어진 학습범위에서 새로운 점검에 도전하고 싶다.